1、細(xì)胞傳代

1） 細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 80%面積時(shí)，棄 25cm2 培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞一次；

2） 添加 0.25%胰蛋白酶消化液約 1ml 至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入 5ml *培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm 離心 5min；

3） 棄上清，沉淀細(xì)胞用 1-2ml *培養(yǎng)基重懸，然后按 1:2 比例進(jìn)行分瓶傳代，后放入 37℃，5%CO₂ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

2、細(xì)胞凍存：

1） 細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的 80%面積時(shí)，棄 25cm2 培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞一次；

2） 添加 0.25%胰蛋白酶消化液約 1ml 至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管中，1000rpm 離心 5min；

3） 用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4） 先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h 后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。

3、細(xì)胞復(fù)蘇：

1） 從液氮中取出細(xì)胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入 37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2） 將凍存管中的細(xì)胞移至含 6ml *培養(yǎng)基的 15ml 離心管中， 1000rpm 離心 5min；

3） 棄上清，沉淀用 6ml *培養(yǎng)基重懸，接種 25cm2 培養(yǎng)瓶，于 37℃，5%CO₂ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；